引文：本文將介紹無(wú)菌檢查方法驗證的具體要求與實(shí)施方法，同時(shí)還將對新GMP的檢查重點(diǎn)進(jìn)行剖析，最后本文總結了無(wú)菌檢查方法的注意事項，以幫助讀者應對新GMP檢查中容易出現的重點(diǎn)問(wèn)題。

 

無(wú)菌檢查方法是為了檢查藥典要求無(wú)菌的制劑及其他制品是否無(wú)菌而建立的試驗方法，是作為無(wú)菌產(chǎn)品批放行的重要依據及藥監部門(mén)對無(wú)菌產(chǎn)品質(zhì)量監管的一個(gè)重要項目。因此如何確保無(wú)菌檢查方法的準確可靠至關(guān)重要，而檢查方法的驗證是保證檢查結果的公正、科學(xué)和準確的基礎，因此各個(gè)主要國家的GMP或藥典都對無(wú)菌檢查方法的驗證提出了嚴格的要求，2010版中國藥典對分析方法驗證和檢查的要求也有大幅度的提高，同時(shí)也是GMP檢查中檢查的重點(diǎn)和容易發(fā)現問(wèn)題的區域。

 

驗證要求與方法

無(wú)菌檢查方法驗證一般分為前驗證和再驗證兩種。

前驗證，也稱(chēng)預驗證，指在無(wú)菌分析方法正式使用前，按照預定驗證方案進(jìn)行的驗證。如果沒(méi)有充分的理由，任何檢查方法必須進(jìn)行前驗證。

再驗證，指某一檢查方法經(jīng)過(guò)驗證并在使用一段時(shí)間后進(jìn)行的，旨在證實(shí)已驗證狀態(tài)沒(méi)有發(fā)生飄移而進(jìn)行的重新驗證及對檢查方法進(jìn)行修訂、改變時(shí)進(jìn)行的驗證。

通常一個(gè)無(wú)菌產(chǎn)品的檢查流程為：首先基于產(chǎn)品的劑型、溶解度等性質(zhì)，按照藥典的要求確定是否需要進(jìn)行前處理;然后根據產(chǎn)品的特性是否有抑菌性，確定是否需要增加去除產(chǎn)品抑菌性的方法;最后驗證整個(gè)檢查方法中用到的一切及試驗過(guò)程中的每一個(gè)環(huán)節包括樣品的預處理方式、檢查過(guò)程、培養條件等均不影響樣品中微生物的生長(cháng)。

這里，驗證的重點(diǎn)環(huán)節包括：

• 前處理方法直接影響后續步驟的效果和重現性，應是驗證的重點(diǎn)。
• 供試品中抑菌活性的去除是當前驗證工作的重點(diǎn)，尤其強調應充分驗證供試品本身對微生物生長(cháng)的影響。

 

具體的驗證方法如下：

菌種的選擇

無(wú)菌檢查方法驗證中通常選擇以下6種試驗中常用的控制菌的標準菌株，它們分別代表不同類(lèi)型的菌種: 枯草芽孢桿菌 [CMCC(B)63 501]代表藥品中常見(jiàn)的污染菌-芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌 [CMCC(B)26 003]代表革蘭陽(yáng)性菌、生孢梭菌 [CMCC(B)64 941]代表厭氧菌、大腸埃希菌 [CMCC(B)44 102]代表革蘭陰性菌、白色念珠菌 [CMCC(F)98 001]代表酵母菌、黑曲霉菌 [CMCC(F)98 003]代表霉菌。

菌液的制備

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營(yíng)養肉湯培養基中或營(yíng)養瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30~35 ℃培養18~24h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上，23~28℃培養24~48h，上述培養物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數小于100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23~28 ℃培養5~7天，加入3~5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數小于100cfu的孢子懸液。

樣品的前處理

無(wú)菌產(chǎn)品中每個(gè)成分應該是均勻的，因此只要確定在驗證的方法中，按所需的總接種量即可，而不必像樣品日常檢測中按規定的容器數取樣。

如果制備樣品時(shí)需要使用溶解劑、稀釋劑、助溶劑、破乳劑等溶劑，需要確保這些溶劑是有效的、并且其使用對微生物生長(cháng)無(wú)影響;或者制備過(guò)程中需要對樣品進(jìn)行加熱助溶、離心等操作是，需要確保加熱的溫度、離心速度和離心時(shí)間等對微生物生長(cháng)或分布無(wú)影響。不需前處理的樣品免做。

消除樣品抑菌性的方法

無(wú)抑菌性樣品的驗證方法：依據產(chǎn)品溶解性和微生物限度選擇合適的中性稀釋劑溶解和稀釋?zhuān)弥苯咏臃N法驗證，常用中性稀釋液或淋洗液。

對于具有抑菌性樣品的驗證方法，首先確定樣品的抑菌作用(抑細菌、真菌試驗驗證)，選擇敏感標準菌株對供試品抑菌活性去除效果檢查(陽(yáng)性菌回收試驗)。常用的消除樣品抑菌活性的方法如下：

• 稀釋法：利用降低供試品的相對濃度，將樣品稀釋至最低抑菌濃度下進(jìn)行。如：取規定量的樣品溶液至較大量的培養基中，使單位體積內的樣品含量減少，至不含抑菌作用。
• 薄膜過(guò)濾法：利用體積差異分離，通過(guò)薄膜過(guò)濾，微生物被截于濾膜，培養薄膜觀(guān)察有無(wú)微生物生長(cháng)。通常薄膜孔徑應不大于0.45μm，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應進(jìn)行相應的調整。濾器和濾膜在使用前采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。使用時(shí)應保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤濕濾膜。油類(lèi)供試液其濾膜和濾器在使用前應充分干燥。供試液經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100ml?？倹_洗量不得超過(guò)1000ml。
• 化學(xué)中和法：利用化學(xué)(生物)專(zhuān)屬性滅活，常用中和劑或滅活方法有：對氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。對化學(xué)中和劑不敏感的樣品，用酶中和，如β -內酰胺酶。
• 聯(lián)合使用：將以上兩種或幾種方法組合運用，以消除樣品的抑菌性。適用于抑菌作用較強的中西藥制劑。

 

其次按照以下要求制備三組樣品：

• 樣品組：選擇以上適當的方法中和樣品，加入少量驗證微生物(接種量少于100cfu)。
• 對照組：0.1%蛋白胨或pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,加少量微生物(接種量少于100cfu)。
• 陽(yáng)性對照組：將試驗菌株直接接種于培養基中(接種量少于100cfu)。

 

最后結果分析如下：

樣品組與對照組微生物生長(cháng)數量相似，表明中和劑的中和方式有效消除了樣品的抑菌性(即有效性)，如果對照組與陽(yáng)性對照組的微生物數量相似，表明樣品預處理、消除樣品抑菌性的方法、檢測程序和培養條件等均不影響微生物生長(cháng)(即無(wú)毒性)。樣品如無(wú)抑菌性，省去對照組試驗，樣品組與陽(yáng)性對照組直接比較。樣品組微生物生長(cháng)數量不及陽(yáng)性對照組微生物生長(cháng)數量，表明樣品的預處理、試驗用器具材料、培養條件等方面存在對微生物生長(cháng)不利的因素。

為考查驗證方法的穩定性和重現性，驗證至少需3個(gè)不同批次的同類(lèi)樣品，分別進(jìn)行3次驗證試驗。

 

無(wú)菌檢查方法驗證試驗設計

薄膜過(guò)濾法：按照藥典的要求取每種培養基規定接種的樣品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100cfu的試驗菌，過(guò)濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養或改良馬丁培養基中，或將培養基加至濾桶內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。按照藥典的要求的溫度和時(shí)間進(jìn)行培養。

直接接種法：取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接入小于100cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2管;取符合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管，分別接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培養基規定的供試品接種量，另1管作為對照，按照藥典的要求的溫度和時(shí)間進(jìn)行培養。

結果判斷

同對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長(cháng)良好，則說(shuō)明驗證通過(guò);如含供試品的任一容器中的試驗菌生長(cháng)微弱、緩慢或不生長(cháng)，驗證失敗，應采用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑和滅活劑、更換濾膜等方法，消除供試品的抑菌作用，重新進(jìn)行驗證。

新GMP檢查重點(diǎn)

首先要檢查方法驗證方案設計的科學(xué)性和完整性，是否有與藥典方法相悖的地方，尤其是產(chǎn)品本身的抑菌性，檢查方法的選擇，是直接接種法還是薄膜過(guò)濾法等。

無(wú)菌檢查方法驗證的硬件是否具備及是否已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)的確認。如使用黑曲霉菌是否具有生物安全柜并進(jìn)行確認，無(wú)菌室的確認及日常監測，培養箱的型號及數量和進(jìn)行確認的情況等，智能集菌器、全封閉無(wú)菌試驗過(guò)濾培養器的型號、性能，濾膜是否符合規定等。

驗證中各個(gè)環(huán)節有關(guān)數據的真實(shí)性，如產(chǎn)品本身抑菌性試驗數據，菌種回收率和培養基適用性和靈敏度檢查數據，菌種的傳代、銷(xiāo)毀和使用記錄，無(wú)菌檢查操作記錄、培養記錄等。

無(wú)菌檢查中偏差的處理是否真的找到了根本原因，是否在沒(méi)有確切的原因前就對樣品重新檢查并依據新的檢查結果放行產(chǎn)品。

驗證的方法與無(wú)菌檢查操作規程和無(wú)菌檢查記錄是否完全一致，如操作步驟、檢查方法、檢查環(huán)境、試驗耗材均需與實(shí)際檢查操作規程及驗證過(guò)程完全相符。

 

為了考查驗證方法的穩定性和重現性，驗證時(shí)是否至少采用了3個(gè)不同批次的同類(lèi)樣品，分別進(jìn)行了3次驗證試驗。

 

使用新的濾膜或過(guò)濾器(不同廠(chǎng)家或批號、型號)是否重新進(jìn)行樣品試驗組、蛋白胨對照組和陽(yáng)性對照組的驗證確認。

除非樣品不能采用過(guò)濾的方法(難溶解)，企業(yè)是否采用全封閉的薄膜過(guò)濾法。

菌液的保存條件和保存期限是否符合藥典的要求，對于黑曲霉孢子懸液是否有驗證的資料。

無(wú)菌檢查的注意事項

實(shí)驗室菌種的處理和保存的程序應標準化，以盡可能減少菌種污染和變異。

試驗時(shí)菌懸液并不是只要活的菌體就行，而是要保持旺盛的生命力，所以菌懸液存放時(shí)間不能太長(cháng)。菌液制備后若在室溫下放置，應在2h內使用，若保存在2～8℃，可在24h內使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過(guò)的貯存期內使用。

薄膜過(guò)濾法采用大樣品量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作相對簡(jiǎn)單。該系統是全封閉過(guò)濾系統，避免了操作過(guò)程中外源性微生物的污染，對試驗結果的可信性影響較小。因此無(wú)菌試驗采用薄膜過(guò)濾法還是直接接種法并不依賴(lài)于驗證結果，而是取決于樣品的特性，如能采用過(guò)濾的方法均應采用薄膜過(guò)濾法檢查。

若樣品含有抑菌成分，當采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，應先將供試液稀釋后在過(guò)濾，這樣可以減少濾膜對樣品的吸附，減少沖洗量，進(jìn)而減少微生物的損失或傷害。

無(wú)菌檢查應作為穩定性考察的項目進(jìn)行，以便對產(chǎn)品有效期的制定和合理的確定儲存條件提供重要的依據。

陽(yáng)性結果的調查：在無(wú)菌檢查中必須小心防止任何可能污染樣品的行為。一旦發(fā)現微生物生長(cháng)，該批產(chǎn)品就被判斷非無(wú)菌，必須進(jìn)行調查。只有可以造成微生物生長(cháng)的明確原因被找出，方可認為最初的陽(yáng)性測試結果無(wú)效。只有確定且書(shū)面記載的證據清楚地證明污染發(fā)生在測試過(guò)程中，方可進(jìn)行重新測試。如果已有證據不明確，產(chǎn)品也必須按照不符合無(wú)菌需求的產(chǎn)品那樣拒絕放行并報廢。在綜合考慮所有與產(chǎn)品制造和樣品測試相關(guān)的因素后，必須匯總成為書(shū)面的調查報告，涵蓋確切的結論和整改措施。

試驗操作流程及數據的關(guān)聯(lián)性、銜接及可追溯性。如儀器使用記錄和試驗記錄的一致，智能集菌器型號數量與試驗記錄一致，菌種收、存、使用記錄與試驗記錄的一致。

 

本文作者：王彥忠

 

中美史克制藥有限公司質(zhì)量部驗證經(jīng)理，國家食品藥品監督管理局培訓中心客座教授。

 

本文來(lái)源：《制藥業(yè)》